کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در صنایع غذایی

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC) از جمله تکنیک ‌های جداسازی متداول در بسیاری از علوم است. در یکی از پست‌ های علم فود درباره کروماتوگرافی صحبت کرده‌ ایم. در این مقاله قصد داریم به طور کامل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در صنایع غذایی را بررسی کنیم. تا پایان این مطلب با علم فود همراه باشید.

 

HPLC چیست؟

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (High performance liquid Chromatography) قبلا به نام کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (High pressure liquid chromatography)  نامیده می ‌شد. این تکنیک مهم ترین و متداول ترین روش کروماتوگرافی است و برای محدوده وسیعی از مواد غیر فرار در زمینه های مختلف علوم کاربرد گسترده ای دارد.

در این روش با استفاده از فشار بالای مایع به عنوان حلال، جداسازی اجزای ترکیب مورد نظر صورت می ‌گیرد. کروماتوگرافی روشی برای شناسائی، جدا سازی و اندازه گیری مواد است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. فاز ثابت آن ممکن است جامد و یا مایع باشد ولی فاز متحرک فقط مایع است.

 

 

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در صنایع غذایی

در این قسمت انواع کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در صنایع غذایی را بررسی میکنیم:

آنالیز افزودنی های غذایی

آماده سازی نمونه : آماده سازی نمونه به شدت به ماده مورد تجزیه و تحلیل بستگی دارد. برای نمونه های کم چربی می توان از استخراج مایعات با حمام فرا صوتی استفاده کرد. برای نمونه هایی با ماتریس های پیچیده تر، استخراج فاز جامد، استخراج مایع/ مایع یا تقطیر با بخار ممکن است لازم باشد.

 

آنتی اکسیدان‌ ها

• آنالیز آنتی اکسیدان های طبیعی مانند ویتامین ث، ویتامین ای
• آنالیز میزان آنتی اکسیدان های مصنوعی مانند BHA، BHT، پروپیل گالات (آنتی اکسیدان های مصنوعی روغن)

نگهدارنده ‌های مواد غذایی

آنالیز میزان نگهدارنده ها مثل سوربیک اسید، پروپیونیک اسید و بنزوئیک اسید

شیرین کننده های مصنوعی

بررسی آسسولفام K، ساخارین و آسپارتام

رنگدانه ها

آماده سازی نمونه های خوراکی برای آنالیز رنگدانه آنها:

در حالی که نمونه های کدر به فیلتراسیون نیاز دارند، نمونه های جامد باید با آمونیاک 0.1٪ در یک مخلوط 50٪ اتانول و آب مخلوط و پس از آن سانتریفوژ شوند. استخراج سپس با استفاده از روش به اصطلاح الیاف پشم انجام می شود. پس از جذب رنگ و فیلتراسیون، می توان محلول را مستقیماً به دستگاه HPLC تزریق کرد.

طعم دهنده ها

آنالیز نارنجین، هسپریدین و وانیلین

آماده سازی نمونه ها برای آنالیز عامل طعم دهنده وانیلین با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا: نمونه های کدر به فیلتراسیون نیاز دارند ، در حالی که نمونه های جامد باید با اتانول استخراج شوند. پس از فیلتراسیون، محلول می تواند مستقیماً به دستگاه HPLC تزریق شود.

آنالیز باقی مانده و آلاینده ها

باقی مانده تتراسایکلین

از تتراسایکلین ها در سراسر جهان به عنوان داروی خوراکی یا تزریقی به صورت افزودنی در خوراک دام استفاده می شود. این داروها فعالیت بالایی نسبت به طیف وسیعی از باکتری ها از خود نشان می دهند.

آماده سازی نمونه برای بررسی میزان تتراسایکلین با کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا: پس از همگن سازی یا خرد کردن و افزودن مینرال اسید ها برای جداسازی تتراسایکلین ها از پروتئین ها، نمونه ها با استفاده از استخراج مایع/مایع و به دنبال آن چربی زدایی و یا پروتئین زدایی و تصفیه استخراج شدند

 

سایر کاربردهای کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا در صنایع غذایی:

•  آنالیز باقیمانده سموم و حشره کش ها
• آنالیز پروتئین ها، اسیدهای آمینه، قندها، کلسترول، انواع ویتامین ها و ..
• تشخیص تقلب در مواد غذایی
• اندازه ‌گیری و شناسایی اسانس ‌ها در مواد غذایی
•  اندازه ‌گیری و شناسایی ترکیبات موجود در عصاره‌ های گیاهی

فاز متحرک در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. فاز ثابت آن ممکن است جامد و یا مایع باشد ولی فاز متحرک فقط مایع است.

فاز متحرک

• حلال آلی:  در صورت استفاده از حلال آلی در HPLC به عنوان فاز متحرک باید از حلال‌ های دارای درجه خلوص(HPLC-grade) استفاده شود. همچنین در موقع استفاده از حلا‌ل ‌ها باید به پایدار کننده‌ های آن توجه گردد.

 

• آب : درصورت استفاده از آب به به‌ عنوان فاز متحرک در HPLC باید از آب بسیار خالص(Ultra pure water) استفاده شود. همچنین میتوان از آب تقطیر شده با نام distilled water for HPLC استفاده نمود.

 

اساس جداسازی در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

اساس جداسازی در روش‌ های کروماتوگرافی تمایل نسبی هر کدام از اجزای موجود در فاز متحرک به فاز ثابت در هنگام عبور فاز متحرک بر روی فاز ساکن است. به این ترتیب ماده ای که تمایل بیشتری به فاز ثابت دارد با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می ‌کند و همچنین گونه ‌ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری از ستون عبور می ‌کند.

 

بررسی اجزا و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC

این دستگاه از 5 قسمت اصلی تشکیل شده است :

• مخازن حلال
• سیستم انتقال حلال(پمپ)
• واحد تزریق کننده
• آون ستون
• آشکارساز

 

دوره آموزشی متخصص آزمایشگاه مواد غذایی 

مجموعه علم فود با همکاری یکی از آزمایشگاه های همکار غذا و دارو و سازمان دامپزشکی، دوره آزمایشگاه میکروبی مواد غذایی و آزمایشگاه شیمی مواد غذایی را به صورت کاملا عملی و تحلیلی تهیه کرده است. در این دوره آزمایش های مهم شیمی مواد غذایی از جمله جدول تغذیه ای مواد غذایی که جزء آزمایشات مهم هستند به صورت کاملا عملی آموزش داده شده است.

از مواردی که در دوره عملی آزمایشگاه شیمی آموزش داده شده میتوان به اندازه گیری پروتئین، چربی، قند، نمک، اسیدیته، خاکستر، دانسیته، رطوبت و آزمایشات مهم دیگر مانند اندازه گیری نشاسته در فراورده های گوشتی و اندازه گیری اسیدیته، پراکسید استخراجی روغن و اندازه گیری فیبر خام در مواد غذایی، اندازه گیری کلسیم در مواد غذایی و غیره اشاره کرد.

همچنین در دوره آزمایشگاه میکروبیولوژی مواد غذایی سعی شده چالش های احتمالی در آزمایشگاه میکروبی مواد غذایی بررسی و راه حل هایی برای آن ارائه گردد. نحوه رقت سازی، ساخت محیط کشت، بررسی استاندارد، نحوه افزودن مکمل ها و نحوه کشت و شمارش میکروارگانیسم های مهم و مشترک بین مواد غذایی در این دوره آموزش داده شده است. برای آشنایی با این دوره ها بر روی ثبت نام و شروع یادگیری دوره های شیمی و میکروب کلیک کنید (با امکان دریافت گواهینامه از آزمایشگاه همکار غذا و دارو و سازمان دامپزشکی).

بعد از گذراندن این دوره به آزمایشات مهم و اصلی که بین اکثر مواد غذایی مشترک است، مسلط میشوید. گواهینامه این دوره معتبر هست و برای استخدام شدن در جایگاه مسئول فنی و یا مسئول کنترل کیفیت میتونید مدرک این دوره رو به سازمان غذا و دارو ارائه بدید. همچنین این دوره برای افرادی که تمایل به یادگیری آزمایشات و یا گذراندن کارآموزی دارند بسیار مناسب است. گواهینامه این دوره دارای اعتبار و قابل ترجمه برای مهاجرت به خارج از کشور است.

 

مخازن حلال در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

 یک دستگاه HPLC به یک و یا تعداد بیشتری مخازن شیشه ای مجهز است که گنجایش  ۵۰۰ میلی لیتر و یا بیشتر حلال را دارا هستند.

 

سیستم انتقال حلال

سیستم انتقال حلال که در واقع همان پمپ‌ ها هستند باید دارای ویژگی ‌های زیر باشند:

• توانایی کار در فشار بالا
• عدم ایجاد نوسان در فشار بالا
• پایدار بودن سرعت جریان ( سرعت جریان حلال در لوله باید دقیق و بدون نوسان باشد که این سرعت برحسب میلی لیتر بر دقیقه بیان می ‌شود)
• جا به ‌جایی راحت حلال در پمپ
• قابلیت تنظیم سرعت جریان در گستره وسیع درون پمپ

 

انواع پمپ ‌های HPLC

1. پمپ‌ های سرنگی
2. پمپ ‌های پیستونی ( عمده‌ ترین نوع مورد استفاده)
3. پمپ‌ های دیافراگمی

 

پمپ ‌های پیستونی

متداولترین نوع پمپ مورد استفاده در HPLC، پمپ‌ های ستونی می ‌باشد.
دو مدل پمپ پیستونی داریم:

• پمپ ‌های تک پیستونی
• پمپ‌ های دو پیستونی

پمپ ‌های تک ‌پیستونی :

این نوع پمپ‌ ها یک موتور دارند که پیستون را جا به‌ جا می ‌کند. همانطورکه در شکل زیر می بینید :

1. وقتی پیستون به عقب حرکت می ‌کند، از سمت پایین حلال به ‌داخل کشیده میشود
2. وقتی پیستون به سمت جلو حرکت می ‌کند حلال از سمت خارج میشود.

همانطورکه در شکل دیده می ‌شود، گلوله‌ هایی از جنس یاقوت درون شیارها قرار دارد. یاقوت دارای مقاومت مکانیکی که دیر دچار ساییدگی می ‌شود. دلیل وجود این گلوله ‌ها این می‌‌‌باشد که زمانی ‌که حلال از پایین وارد می ‌شود از همان راه مجددا خارج نگردد.
در پمپ ‌های تک پیستونی تنها یک پمپ وجود دارد که حلال از یک طرف آن وارد و از طرف دیگر آن خارج می‌ شود. در نتیجه ممکن است به‌ صورت پیوسته کار نکند. همانطورکه در قبل اشاره کردیم پمپ‌ ها نباید نوسان فشار داشته باشند در نتیجه این عیبی است که می ‌توان به پمپ‌ های تک ستونی وارد نمود.

 

 

پمپ ‌های دو پیستونی:

این پمپ ‌ها به صورت موازی یا سری در کنار هم قرار گرفته‌ اند. زمانی‌ که 2 پمپ داشته باشم دیگر مشکل نوسان فشار نداریم. در واقع این حالت بهتر از پمپ تک پیستونی است. زیرا یکی از پیستون ‌ها در حال پرکردن و دیگری درحال تخلیه می‌ یاشد و به‌ همین دلیل به ‌صورت پیوسته کار می ‌کند.

 

 

واحد تزریق ‌کننده کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

واحد تزریق ‌کننده یا Injector در واقع نقش تزریق کننده نمونه مورد آنالیز به داخل حلال عبوری را در دستگاه کروماتوگرافی مایع بازی می کند. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که می تواند بین پمپ و ستون قرار بگیرد. این قسمت با فشار زیاد، مقدار معینی از نمونه را به داخل حلال درحال حرکت هدایت می ‌کند. واحد تزریق کننده باید دارای ویزگی‌ های زیر باشد :

• Injector باید بتواند نمونه را در یک مسیر مشخص حرکت حرکت دهد
•  حبابی در حلال وارد یا ایجاد نکند.
• درون آن نمونه ‌ای باقی نماند.
• تاثیر کمی در پهن شدگی پیک بگذارد.
• کمترین هدر رفت نمونه را داشته باشد.
• پایداری و مقاومت بالا در برابر فشار
• قابلیت تنظیم آزاد حجم تزریق

این واحد برای کار کردن در دو مد قرار دارد. در واقع در داخل تزریق کننده شیارها و کانال‌ ها در دو حالت زیر دارای اتصالات متفاوتی هستند :

• مد LOAD

• مد INJECT

 

برای تزریق در دستگاه HPLC همچنین می‌ توان از تزریق دستی استفاده کرد. در تزریق دستی دو روش وجود دارد:

روش اندازه ‌گیری سرنگ:

• در این روش حجم نمونه توسط سرنگ اندازه‌ گیری و تزریق می ‌شود.
• در این روش به ‌راحتی می ‌توان حجم تزریقی را تنظیم کرد.
• همچنین بهتر است که بیشتر از نصف حجم لوپ(یک لوله توخالی دارای حجم مشخص) تزریق صورت نگیرد.

 

روش اندازه‌ گیری لوپ :

• در این روش تکرارپذیری تزریق بالا است.
• در این روش بهتر است که حداقل 3برابر حجم لوپ ( یک لوله توخالی دارای حجم مشخص) تزریق صورت بگیرد.
• برای تغییر حجم تزریق باید لوپ عوض شود.

 

آون ستون کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

ستون کروماتوگرافی و یا column مرکز جداسازی اجزای نمونه در کروماتوگرافی مایع است. عملکرد این ستون ها به زبان ساده نگهداری و رها سازی مولکول های جزء به جزء ترکیب به ترتیب بزرگی و یا چسبندگی مولکول ها و قدرت شستشوی نمونه توسط حلال می باشد. در دستگاه HPLC ستون را از محیط جدا می کنند تا نوسان نداشته باشد. ستون را در آون قرار می ‌دهند و دمای آن از ابتدا تا انتهای آنالیز باید یکنواخت بماند. باید توجه نمود که در کروماتوگرافی مایع، کنترل دما اهمیت زیادی دارد.

 

مزایای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در صنایع غذایی

1. قدرت جداسازی بالا
2. تکرارپذیری بسیار بالا
3. شرایط کاری متوسط (برخلاف کروکاتوگرافی گازی نیاز به تبخیر نمونه ندارد)
4. عموما دارای حساسیت بالا
5. مصرف کم نمونه
6. امکان جداسازی تهیه ‌ای برای کاربرد در صنعت و خالص‌ سازی نمونه ها برای کاربردهای آزمایشگاهی

 

 سایر کاربردهای HPLC

صنعت دارویی:

•  برای برای تحقیق و توسعه جهت شناسایی و آنالیز داروهای جدید
• اندازه‌ گیری و شناسایی مواد موثره دارویی
• آنالیز کیفی و تعیین مقدار داروها و میزان مواد جانبی در داروها

محیط زیست: 

• آنالیز انواع آلاینده های محیطی در آب و پساب ها
• اندازه‌گیری و شناسایی انواع فنل‌ ها در نمونه‌ های آب آشامیدنی، فاضلاب شهری، خروجی کارخانجات

صنعت:

• بیوتکنولوژی
• پتروشیمی

 

دوست عزیز علم فودی اگر می خوای از دوره های تخصصی که علم فود برگزار میکنه باخبر بشی و کلی مطلب علمی در زمینه صنایع

غذایی یاد بگیری علم فود رو در اینستاگرام هم دنبال کن (کافیه روی عکس زیر کلیک کنی تا وارد پیج علم فود بشی):

منابع:

HPLC for Food Analysis

علم فود