کروماتوگرافی لایه نازک چیست؟ یکی از پرکاربردترین روش‌های جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روش‌های دیگر ناممکن است به راحتی میتوان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافات‌های جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آنها از یک سیستم کروماتوگرافی می‌شود. کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک در صنایع غذایی یکی از روش‌های کلاسیک کروماتوگرافی است که در مطلب امروز قصد داریم درمورد آن صحبت کنیم.
TLC یا کروماتوگرافی لایه نازک چیست؟
کروماتوگرافی لایه نازک نوعی از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در این روش از صفحات با ضخامت نازک استفاده می‌شود و موقعیت اجزای جدا شده روی صفحه مشخص می‌گردد. تکنیک کروماتوگرافی لایه نازک روشی برای شناسایی مواد و آزمایش خلوص آنهاست. این روش نسبتا سریع است و به مقدار کمی ماده نیاز دارد. جداسازی در این تکنیک شامل توزیع آنالیت‌ها بین فاز ساکن و فاز متحرک میباشد. مانند سایر روش‌های کروماتوگرافی جداسازی اجزای نمونه براساس میزان جذب آنها بر روی فاز ساکن در مقابل میزان انحلال آنها در فاز متحرک است.
مانند سایر تکنیک های کروماتوگرافی، کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) به اصل جداسازی بستگی دارد. جداسازی به میل نسبی ترکیبات نسبت به هر دو فاز متکی است. ترکیبات در فاز متحرک روی سطح فاز ساکن حرکت می کنند. حرکت به گونه ای اتفاق می افتد که ترکیباتی که میل ترکیبی بیشتری با فاز ساکن دارند به آرامی حرکت می کنند در حالی که سایر ترکیبات سریع حرکت می کنند. بنابراین، جداسازی مخلوط حاصل می شود. پس از تکمیل فرآیند جداسازی، اجزای جداگانه از مخلوط به صورت لکه هایی در سطوح مربوطه روی صفحات ظاهر می شوند. ماهیت آنها با تکنیک های تشخیص مناسب شناسایی می شود.
بررسی مفاهیم پایه در کروماتوگرافی لایه نازک
فاز ساکن:
لایه‌نازکی از یک پودر بر روی محیط پشتیبان جامد می باشد.
فازمتحرک:
مایع توسعه‌دهنده‌ای است که بر روی فاز ساکن حرکت کرده و نمونه را با خود جابه‌جا می‌کند. منظور از مایع توسعه‌دهنده در اینجا حلال است.
Rf :
نسبت فاصله طی شده توسط حل‌شونده به فاصله طی شده از خط ابتدایی تا حلال
باتوجه به مفهوم Rf، ملاک شناسایی کیفی در کروماتوگرافی لایه نازک، فاصله طی شده توسط هر لکه از نقطه شروع میباشد. ترکیبی که کمتر جذب فاز جامد( فاز ساکن) شود و بیشتر در حلال(فاز متحرک) حل گردد، سریعتر حرکت می‌کند و درنتیجه مسیر بیشتری را طی کرده و Rf بزرگتری حاصل می‌شود. باتوجه به تعریف Rf برای ترکیباتی که در حلال خیلی محلول هستند، Rf نزدیک به 1 است. برای ترکیباتی هم که حلالیت کمی در حلال دارند، Rf نزدیک به صفر است.
روش آماده‌سازی صفحه
- در فاصله 0.5 تا 1 سانتی متری انتهای صفحه یک خط با مداد کشیده می‌شود(توجه کنید که حتما خط با مداد کشیده شود)
- نمونه گذاری بر روی خط کشیده شده صورت می‌گیرد و محل‌های نمونه‌گذاری را با شماره مشخص می‌کنیم.
- برای لکه‌گذاری از لوله‌های کاپیلاری یا موئین میتوان استفاده نمود. به‌این صورت که این لوله‌ها را داخل محلول نمونه قرار می‌دهیم( برای انتقال بیشتر نمونه به صفحه میتوان از خلال‌های کوچک برای لکه‌گذاری استفاده نمود)
- بعد از هر لکه‌گذاری صفحه را خشک می‌کنیم. هدف از خشک کردن در اینجا تبخیر حلال است که می توان با جریان هوای آزاد این کار را انجام داد.
- درون ظرف، حلال(eluent) می‌ریزیم. توجه کنید که میزان حلال ریخته شده باید پایین‌تر از خط کشیده شده در انتهای صفحه باشد.
- TLC را درون حلال قرار می‌دهیم. حلال به‌صورت کاپیلاری به سمت بالا حرکت می‌نما‌ید و در حین حرکت نمونه‌ها را ( که به‌صورت لکه‌هایی بر روی خط قرار داده بودیم) جابه‌جا می‌کند. مقداری که لکه‌ها توسط حلال جابه‌جا شوند بستگی به میزان انحلال آنها در حلال دارد.
- اجازه می‌دهیم سطح حلال تا فاصله 0.5 تا 1 سانتی متری انتهای صفحه، بالا بیاید. بعد از رسیدن به این فاصله درپوش را برمی‌داریم و صفحه TLC را خارج می‌کنیم و می گذاریم تا خشک شود. (توجه کنید که بعد از خارج کردن صفحه، سریع باید علامت گذاری را انجام دهید زیرا ممکن است حتی بعد خروج صفحه هم حلال به حرکت خودش ادامه دهد)
حلال های مورد استفاده در کروماتوگرافی لایه نازک
برای جداسازی از نسبت حلال‌های مختلف استفاده می کنیم.
| حلال‌هایی با قطبیت پایین | حلال‌هایی با قطبیت متوسط | حلال‌هایی با قطبیت بالا |
|---|---|---|
| هگزان | هگزان | متانول |
| دی اتیل اتر | دی اتیل استات | دی کلرومتان |
به‌عنوان مثال قصد داریم دو ترکیب فلورن و فلورونون را به وسیله کروماتوگرافی لایه نازک جدا کنیم. ماده فلورونون به دلیل داشتن گروه کربونیل قطبی‌تر از فلورن میباشد. برای جداسازی هم از حلال های هگزان – دی اتبل اتر استفاده می‌کنیم.
در ابتدا فرض کنید که 100% از حلال دی اتیل اتر و 0% از حلال هگزان استفاده می کنیم. از آنجاکه دی اتیل اتر دارای قطبیت بالاتری نسبت به هگزان است و قدرت انحلال بالایی دارد هر دو ترکیب را به سمت جبهه حلال می‌برد. در واقع در اینجا هیچ جداسازی رخ نمی‌دهد و برای هر دو ترکیب Rf برابر یک خواهد شد. پس در اینجا بهتر است قطبیت را کاهش دهیم مثلا 20% هگزان اضافه کنیم.
هرچه هگزان بیشتری اضافه کنیم ترکیب قطبی‌تر یعنی فلورونون کمتر جابه‌جا می‌شود. به‌همین دلیل با بیشتر جابه‌جا شدن فلورن با هگزان، میزان Rf آن افزایش می‌یابد و اختلاف آن باRf فلورونون زیاد می شود. فرض کنید که حالا از 100% هگزان استفاده کنیم، در اینجا Rf فلورونون صفر خواهد شد. در واقع فلورونون در همان خط اولیه باقی می‌ماند زیرا حلال آنقدر غیرقطبی شده که دیگر نمی‌تواند این ترکیب را جابه‌جا کند.
از این مثال متوجه میشویم که بهترین زمان جداسازی زمانی است که مولکول‌ها دارای Rf متفاوت باشند پس نیاز است از نسبت‌های مناسب حلال استفاده کنیم.
دوره آموزشی متخصص آزمایشگاه مواد غذایی
مجموعه علم فود با همکاری یکی از آزمایشگاه های همکار غذا و دارو و سازمان دامپزشکی، دوره آزمایشگاه میکروبی مواد غذایی و آزمایشگاه شیمی مواد غذایی را به صورت کاملا عملی و تحلیلی تهیه کرده است. در این دوره آزمایش های مهم شیمی مواد غذایی از جمله جدول تغذیه ای مواد غذایی که جزء آزمایشات مهم هستند به صورت کاملا عملی آموزش داده شده است. از مواردی که در دوره عملی آزمایشگاه شیمی آموزش داده شده میتوان به اندازه گیری پروتئین، چربی، قند، نمک، اسیدیته، خاکستر، دانسیته و آزمایشات مهم دیگر اشاره کرد.
همچنین در دوره آزمایشگاه میکروبیولوژی مواد غذایی سعی شده چالش های احتمالی در آزمایشگاه میکروبی مواد غذایی بررسی و راه حل هایی برای آن ارائه گردد. نحوه رقت سازی، ساخت محیط کشت، بررسی استاندارد، نحوه افزودن مکمل ها و نحوه کشت و شمارش میکروارگانیسم های مهم و مشترک بین مواد غذایی در این دوره آموزش داده شده است. برای آشنایی با این دوره ها بر روی ثبت نام و شروع یادگیری دوره های شیمی و میکروب کلیک کنید.
دوره های تخصصی آزمایشگاه مواد غذایی
دوره آزمایشگاه شیمی مواد غذایی
آموزش صفر تا صد آزمایشگاه شیمی مواد غذایی به صورت عملی در سایت علم فود به همراه گواهینامه معتبر آموزشی
دوره آزمایشگاه میکروبی مواد غذایی
دوره تخصصی آزمایشگاه میکروبیولوژی مواد غذایی به همراه آموزش اصول تخصصی کار در آزمایشگاه مواد غذایی
عیب‌یابی کروماتوگرافی لایه نازک
زمانی که لکه‌ها همراه با حلال جابه‌جا می‌شوند، ممکن است اشکالاتی ایجاد شود که فرآیند جداسازی را مختل نماید که در ادامه به این اشکالات و بررسی راه‌حل آنها اشاره می‌کنیم :
- اگر لکه‌ها در حین حرکت با حلال بر روی صفحه به‌صورت خط کشیده ظاهر شوند :
- علت: مقدار نمونه استفاده شده خیلی زیاد است
- راه‌حل: باید نمونه رقیق شود
- اگر لکه‌ها خیلی کشیده شوند:
- علت: داخل نمونه ترکیبات اسیدی یا بازی وجود دارد که برهمکنش‌‌‌های قوی ایجاد می‌کنند
- راه‌حل: باید به فاز متحرک یا همان حلال، افزودنی اضافه کنیم تا ترکیبات اسیدی یا بازی موجود را خنثی کنند. افزودنی‌هایی با غلظت 2% باید به فاز متحرک اضافه شود. برای محلول‌های اسید کربوکسیلیک به میزان 2% استیک اسید و به ترکیبات آمینی به میزان 2% تری متیل آمین باید اضافه شود.
- اگر لکه‌ها به‌صورت خمیده ظاهر شوند:
- علت: لکه‌گذاری به‌صورت نامناسب انجام شده است. درواقع برای منتقل کرن نمونه به صفحه فشار زیادی وارد آمده و سیلیکا(فازمتحرک) جابه‌جا شده است
- راه‌حل: عمل لکه‌گذاری باید آرام و بدون وارد کردن فشار انجام شود
- اگر لکه‌ها متمابل به یک سمت و به‌صورت شیب‌‌دار حرکت کنند :
- علت: صفحه TLC را درون بشر به درستی قرار ندادیم
- راه‌حل: صفحه TLC را باید در مرکز قرار دهیم
- اگر در کنار لکه‌های درحال حرکت لکه‌های آبی رنگ مشاهده شود:
- علت: برای لکه‌گذاری از خودکار آبی استفاده شده است
- راه‌حل: باید از مداد برای علامت‌گذاری و خط کشی استفاده کنیم
- اگر هیچ لکه‌ای نینیم:
- علت: نمونه خیلی رقیق بوده است یا از آشکارساز مناسبی استفاده نشده است
کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک در صنایع غذایی
از کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) به طور گسترده در آزمایشگاه های سراسر جهان برای تجزیه و تحلیل مواد غذایی و کنترل کیفیت استفاده می شود. از کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک در صنایع غذایی میتوان به اندازه گیری و بررسی افزودنی‌های عمدی، تقلبات ، آلاینده ها و تجزیه شامل تعیین ترکیبات مانند اسیدهای آمینه (کیفیت پروتئین)، لیپیدها و اسیدهای چرب (کیفیت و تقلب در چربی) ، قندها (کیفیت نوشیدنی) ، آمین های بیوژنیک (قابلیت ذخیره پذیری) ، ویتامین ها (به عنوان مواد مغذی ، رنگی و آنتی اکسیدان اضافه می شود) و اسیدهای آلی (مواد نگهدارنده) اشاره کرد.
کروماتوگرافی لایه نازک همچنین به صورت گسترده ای برای تجزیه و تحلیل محصولات کشاورزی و گیاهان کاربرد دارد. موارد زیر نمونه هایی از کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک در صنایع غذایی است که تاکنون در مطالعات مختلف بررسی شده است:
- اندازه گیری آمین ها، آمیدها و آمینواسیدها
- اندازه گیری آنتوسیانین
- اندازه گیری آنتراکینون
- آنتی بیوتیک ها
- کربوهیدرات ها
- فلاوونوئیدها
- ایمازول
- لیپیدها
- حشره کش و آفت کش ها
- ترکیبات فنلی
- رنگدانه های طبیعی و مصنوعی
- سموم
- ویتامین ها
دوست عزیز علم فودی اگر می خوای از دوره های تخصصی که علم فود برگزار میکنه باخبر بشی و کلی مطلب علمی در زمینه صنایع غذایی یاد بگیری علم فود رو در اینستاگرام هم دنبال کن (کافیه روی عکس زیر کلیک کنی تا وارد پیج علم فود بشی):
Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis
